Посібник користувача Qiagen QIAcuity EG PCR Kit

Посібник користувача Qiagen QIAcuity EG PCR Kit

Цей протокол оптимізований для кількісного визначення мішеней ДНК або кДНК за допомогою набору QIAcuity EG PCR Kit (кат. № 250111, 250112 та 250113) з барвником EvaGreen®, що зв’язує дцДНК, у одноплексній реакції з використанням інструментів QIAcuity QIAGEN для цифрової ПЛР ( dPCR). Набір QIAcuity EG PCR Kit слід зберігати відразу після отримання при температурі від –30 до –15 °C у морозилці зі постійною температурою та захищати від світла. Основну суміш QIAcuity EG PCR також можна зберігати в захищеному від світла місці при температурі 2–8°C. Якщо інше не вказано на етикетці, компоненти стабільні протягом 6 місяців без жодного зниження продуктивності за цих умов. Спеціальні протоколи для різних типів аналізів QIAcuity dPCR від QIAGEN можна знайти у відповідних протоколах швидкого запуску та Розширенні посібника користувача QIAcuity: посібник із застосування.

Додаткова інформація

• Розширення посібника користувача QIAcuity: посібник із застосування: www.qiagen.com/HB-2839
• Посібник користувача QIAcuity: www.qiagen.com/HB-2717
• Паспорти безпеки: www.qiagen.com/safety
• Технічна допомога: support.qiagen.com

Примітки перед початком

• Флуоресцентний еталонний барвник надається як компонент основної суміші QIAcuity EG PCR для надійного виявлення належного заповнення розділів у нанопланшетах dPCR.
• Для найвищої ефективності dPCR, ampЛікони в ідеалі повинні мати довжину 60-150 bp. Подібно до КПЦР, довше ampтакож можна використовувати значки; однак, аналіз
  продуктивність може бути погіршена.
• Завжди починайте з умов циклу та концентрацій праймера, зазначених у цьому протоколі.
• ПЛР має починатися з початкового етапу інкубації 2 хвилини при 95°C для активації ДНК-полімерази QuantiNova® у основній суміші.
• Для зручності використання ми рекомендуємо приготувати грунтувальну суміш 10-кратної або більшої концентрації. 10-кратна суміш праймерів складається з 4 мкМ прямого праймера та 4 мкМ зворотного праймера в буфері TE з низьким вмістом EDTA (0.1 мМ).
• Для 2-етапної RT-PCR використовуйте набір для зворотної транскрипції QuantiTect® для першого етапу синтезу кДНК.
  Важливо: Набір для зворотної транскрипції QuantiNova не рекомендується.
  Об’єм доданої кДНК (з нерозведеної реакції зворотної транскрипції) не повинен перевищувати 10% кінцевого об’єму ПЛР, якщо використовується набір для зворотної транскрипції QuantiTect. Якщо використовується інший набір RT, він не повинен перевищувати 5%.

Розщеплення матричної ДНК

• ДНК sampфайли із середньою довжиною ≥20 кб (наприклад, геномна ДНК, очищена за допомогою спінювальної колонки з кремнеземною мембраною або методом висолювання) повинні бути фрагментовані шляхом рестрикційного розщеплення перед розділенням. Ферментативна фрагментація більшої ДНК забезпечує рівномірний розподіл шаблонів по всій нанопланшеті QIAcuity, що, у свою чергу, призводить до точного кількісного визначення.
• Фрагментація ДНК за допомогою рестрикції особливо важлива, коли виконуються аналізи варіації кількості копій (CNV), коли кілька копій гена можуть бути пов’язані в тандемі. Рестрикційне розщеплення не вимагається для сильно фрагментованої ДНК (наприклад, ДНК FFPE або циркулюючої ДНК) або кДНК.
• Слід бути обережним, щоб використовувати ферменти, які не будуть розрізатися всередині ampфікована послідовність. Для аналізів CNV і виявлення мутацій QIAGEN відповідну інформацію можна знайти на geneglobe.qiagen.com.
• Наступні валідовані ферменти розщеплюють ДНК за 10 хвилин при кімнатній температурі (15–25°C) при додаванні безпосередньо до реакційної суміші QIAcuity у зазначених концентраціях.

Таблиця 1. Перевірені ферменти рестрикції

6-кутерні рестриктази 4-кутерні рестриктази
	EcoRI	0.25 Од/мкл EcoRI-HF®, NEB®	AluI	0.025 Од/мкл AluI, NEB
		0.025 Од/мкл Anza™ 11 EcoRI, Thermo Fisher Scientific		0.025 U/мкл Anza 44 AluI, Thermo Fisher Scientific
	ПвуII	0.025 Од/мкл PvuII, NEB	cviQI	0.025 Од/мкл CviQI, NEB
		0.025 Од/мкл Anza 52 PvuII, Thermo Fisher Scientific		0.025 Од/мкл Csp6I (CviQI), Thermo Fisher Scientific
	XbaI	0.025 Од/мкл Anza 12 XbaI, Thermo Fisher Scientific	ПошукIII	0.025 Од/мкл BsuRI (HaeIII), Thermo Fisher Scientific

Процедура

Налаштування реакції

1. Розморозьте базову суміш QIAcuity EG PCR, матричну ДНК або кДНК, праймери та воду, вільну від РНКази. Змішайте окремі розчини.
2. Приготуйте реакційну суміш відповідно до таблиці 2. Завдяки полімеразі гарячого старту немає необхідності зберігати sampна лід під час налаштування реакції або під час програмування приладу QIAcuity.

Таблиця 2. Налаштування реакції

	Обсяг/реакція
Компонент	Нанопланшет 8.5k (24-лунковий, 96-лунковий)	Нанопланшет 26k (24 лунки)	Кінцева концентрація
3x EvaGreen PCR Master Mix (канал FAM)	4 мкл	13.3 мкл	1x
10x грунтувальна суміш	1.2 мкл*	4 мкл*	0.4 мкМ прямого праймера 0.4 мкМ зворотний праймер
Фермент рестрикції (необов'язково)	До 1 мкл	До 1 мкл	0.025–0.25 Од/мкл
Вода без РНКаз	Змінна	Змінна
Шаблон ДНК або кДНК (додається на кроці 4)	змінна†	змінна†
Загальний об'єм реакції	12 мкл	40 мкл

1. Обсяг може змінюватися залежно від концентрації використовуваної суміші для ґрунтування.
2. Відповідна сума шаблону залежить від різних параметрів. Додаткову інформацію див. у Розширенні посібника користувача QIAcuity: Посібник із застосування.
3. Збовтати реакційну суміш.
4. Розподіліть відповідні об’єми реакційної суміші, яка містить усі компоненти, крім матриці, у лунки стандартного планшета для ПЛР. Потім додайте матричну ДНК або кДНК у кожну лунку, яка містить реакційну суміш.
   Примітка: Відповідна кількість реакційної суміші та матричної ДНК залежить від різних параметрів. Будь ласка, зверніться до QIAcuity User Manual Extension: Application Guide для отримання додаткової інформації.
5. Перенесіть вміст кожної лунки зі стандартного ПЛР-планшета в лунки нанопланшета.
6. Належним чином запечатайте нанопластинку за допомогою ущільнювача нанопланшети QIAcuity, який входить до складу наборів нанопластин QIAcuity.
   примітки: Точну процедуру запечатування див. у посібнику користувача системи QIAcuity.
7. Якщо в реакцію включено рестриктазу для розщеплення ДНК, залиште планшет при кімнатній температурі на 10 хв.

Умови термоциклування

1. Запрограмуйте циклер приладу QIAcuity відповідно до таблиці 3.

Таблиця 3. Умови циклювання

Крок	час	Температура (° C)
ПЛР початкова теплова активація	2 хв	95
3-етапний цикл (40 циклів)
Денатурація	15 з	95
отжиг	15 з	55-62 *
Розширення	15 з	72
Охолодження	5 хв	40

Температура під час відпалу/подовження та кількість циклів можуть змінюватися залежно від типу аналізу. Помістіть нанопланшет в прилад QIAcuity і запустіть програму dPCR.

Історія перегляду документа

Дата	Зміни
07/2020	перший випуск
01/2021	Оновлено URL of Розширення посібника користувача QIAcuity: посібник із застосування.

Щоб отримати актуальну інформацію про ліцензування та застереження щодо конкретних продуктів, див

Довідник із комплекту QIAGEN або посібник користувача
Торгові марки: QIAGEN®, Sampперейти до Insight®, QIAcuity®, QuantiNova®; QuantiTect® (QIAGEN Group); EvaGreen® (Biotium, Inc.); Anza™ (Thermo Fisher Scientific або її дочірні компанії); -HF®, NEB® (New England Biolabs, Inc.). Зареєстровані назви, торгові марки тощо, що використовуються в цьому документі, навіть якщо вони спеціально не позначені як такі, не вважаються незахищеними законом. 1123717 01/2021 HB-2791-003 © 2021 QIAGEN, усі права захищено. 4O замовлення www.qiagen.com/shop | Технічна підтримка support.qiagen.com | Webсайт wQIwAwc.uiqityag

Завантажити PDF: Посібник користувача Qiagen QIAcuity EG PCR Kit